Ⅱ級生物安全柜防護(hù)性能檢測與評價(jià)
時(shí)間：2018-09-07 08:54:00 來源： 作者：admin
生物安全柜是保證實(shí)驗(yàn)室生物安全的重要防護(hù) 設(shè)施，可以提供對人員、產(chǎn)品、環(huán)境的保護(hù)。省疾病 預(yù)防控制中心生物實(shí)驗(yàn)室擔(dān)負(fù)著項(xiàng)目繁多、種類復(fù) 雜的檢品，檢驗(yàn)人員的防護(hù)措施主要靠生物安全柜。 為了解生物安全柜的防護(hù)性能，我們以本中心實(shí)驗(yàn) 室引進(jìn)的美國LABCONCO 型Ⅱ級B1 型生物安柜為 代表，對其生物因子防護(hù)性能進(jìn)行了檢測和評價(jià)。 現(xiàn)將檢測結(jié)果報(bào)告如下。
1 材料與方法
1. 1 試驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)設(shè)備為 LABCONCO 型Ⅱ級 B1 型生物安全柜，為美國進(jìn)口產(chǎn)品，位于本中心微生物實(shí)驗(yàn)室。 主要試驗(yàn)儀器有 TK -2 氣溶膠發(fā)生器、安德森二級采樣器、 AGI 液體撞擊式采樣器、熱球式風(fēng)速 儀、聲級計(jì)、照度計(jì)和氣流檢查器等。 試驗(yàn)指標(biāo)菌為枯草桿菌黑色變種( ATCC 9372) 芽孢，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院消毒檢測中心提供;采用胰 酶大豆瓊脂培養(yǎng)基和胰酶大豆液體培養(yǎng)基，均為國 內(nèi)市售產(chǎn)品。 模擬手臂所用的不銹鋼圓筒是按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的 試驗(yàn)方法自行設(shè)計(jì)制作。
1. 2 試驗(yàn)方法
1. 2. 1 氣溶膠發(fā)生液的制備 將枯草桿菌黑色變 種菌種接種于胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基平板劃線分離培 養(yǎng)后，挑取典型菌落接種于胰酶大豆?fàn)I養(yǎng)肉湯培養(yǎng) 基中，于37℃ 培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)物均勻涂布于羅氏 瓶中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，置 37℃培養(yǎng) 7 d ，經(jīng)細(xì) 菌芽孢染色鏡檢，確認(rèn)芽孢形成率 > 95% 時(shí)，收 取芽孢。將新收取芽孢懸液用雙層脫脂紗布過濾， 3 000 r/min 離心 10 min，PBS 緩沖液反復(fù)清洗 3次; 滅活繁殖體，梯度稀釋，活菌計(jì)數(shù)即成芽孢懸 液， 4℃保存?zhèn)溆谩?br />
1. 2. 2 環(huán)境本底采樣 在對安全柜作測試前，先對 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和安全柜進(jìn)行清潔消毒，再用安德森二 級采樣器對生物安全柜所在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境本底進(jìn)行采 樣，以確定測試環(huán)境中是否含有與試驗(yàn)菌相同的細(xì) 菌。采樣流量 28. 3 L/ min，采樣 15 min，對采樣平 板進(jìn)行培養(yǎng)，觀察和鑒定。
1. 2. 3 人員保護(hù)測試 ① 調(diào)整好安全柜內(nèi)氣流: 將安全柜內(nèi)氣流速度設(shè)置為規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)值，讓安全 柜處于工作狀態(tài)。② 發(fā)生氣溶膠:在 TK -2 氣溶膠 發(fā)生器裝入含菌量為 6. 5 × 108 /ml 的芽孢懸液 20 ml，置于安全柜內(nèi)兩側(cè)壁之間，發(fā)生器噴嘴前端在前 窗操作口內(nèi) 10 cm，其軸線在工作臺面上方36 cm 處，以流量為7. 5 L/min，噴射方向平行于工作臺面 且正對前窗操作口進(jìn)行噴霧染菌。③ 采樣: 將外徑 為6. 3 cm 的不銹鋼圓筒固定在安全柜工作臺面上 中心位置，一端貼于安全柜的后壁，另一端從安全柜 的前窗操作口伸出安全柜至少15 cm，圓筒軸線距 工作臺面7 cm;將6 個(gè) AGI 液體撞擊式采樣器呈左 右對稱放置在安全柜前，采樣口正對安全柜; 其中 2 個(gè)采樣器的采樣口軸線相距15 cm、與圓筒上沿平 齊，另2 個(gè)采樣器采樣口軸線相距5 cm、位于圓筒 下沿3 cm 的水平面上，采樣口前端距安全柜均為 6. 3 cm; 然后 2 個(gè)采樣器的采樣口水平面在工作臺 面上方36 cm 處，采樣口前端距安全柜5 cm，采樣口 軸線距安全柜中線 15 cm;所有采樣器的流量均以 12. 0 L/min 進(jìn)行采樣。將陽性對照瓊脂培養(yǎng)基平 板布放在圓筒下，位于前窗進(jìn)氣格柵上方1 cm，作 沉降采樣。④ 安德森采樣器采樣:將2 個(gè)安德森二 級采樣器的采樣口平面與安全柜工作臺面平齊，采 樣口的垂直軸線在安全柜前方15 cm 處，各距側(cè)壁 20 cm;以采樣器流量為 28. 3 L/min 進(jìn)行采樣。⑤ 測試順序:首先啟動安德森二級采樣器采樣， 5 min 后，再啟動 TK - 2 氣溶膠發(fā)生器，共噴霧染菌 6. 5 min; 第 6 min 啟動 AGI 液體撞擊采樣器，采樣5 min;30 min 后停止安德森二級采樣器采樣。⑥ 培 養(yǎng):對 AGI 液體撞擊采樣器的采樣液用一直徑為 4. 7 mm、孔徑0. 22 μm 濾膜進(jìn)行過濾，取出濾膜置 于合適的培養(yǎng)基平板上;將貼有撞擊采樣器采樣液 濾膜的平板、安德森采樣器采樣的平板以及各種對 照平板，均置于37℃培養(yǎng) 24 ～ 28 h 觀察結(jié)果，進(jìn)行 細(xì)菌查計(jì)數(shù);試驗(yàn)重復(fù)3 次。⑦結(jié)果判定:平板上枯 草桿菌黑色變種芽孢生長數(shù)限制值符合以下條件判 定為合格:所有撞擊采樣器采樣液濾膜平板上菌數(shù) 應(yīng)≤10 cfu，安德森采樣器采樣平板上菌數(shù)應(yīng)≤5cfu，陽性對照平板上菌數(shù)應(yīng) > 300 cfu。試驗(yàn)重復(fù) 3 次，均符合要求。
1. 2. 4 產(chǎn)品保護(hù)測試 ①調(diào)整好安全柜內(nèi)氣流: 將安全柜內(nèi)氣流速度設(shè)置為規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)值，讓安全 柜處理工作狀態(tài)。②采樣準(zhǔn)備:在安全柜的工作臺 面上排滿敞開的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板50 個(gè)。將外 徑為 6. 3 cm 圓筒固定在安全柜工作臺面上的中心 區(qū)，一端貼住工作區(qū)的后壁，另一端從前窗操作口伸 出安全柜至少 15 cm，圓筒的軸線高于工作臺面7 cm;將1 個(gè)陽性對照培養(yǎng)基平板放在圓筒下，位于 前窗進(jìn)氣格柵上方1 cm。③ 發(fā)生氣溶膠:在 TK -2 氣溶膠發(fā)生器裝入含菌量為6. 5 ×106 /ml 的芽孢懸 液20 ml，安放在安全柜外，噴射軸在安全柜中心并 與前窗操作口上沿平齊，噴嘴前端位于前窗操作口 外10 cm，噴霧方向平行于工作臺面，正對前窗操作 口;啟動 TK - 2 氣溶膠發(fā)生器，流量為 7. 5 L/min， 噴霧5 min 后關(guān)閉。④ 采樣:讓所有打開的培養(yǎng)基 平板自然沉降10min，立即蓋上平板蓋，置于37℃培 養(yǎng)24 ～48 h 觀察結(jié)果，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù) 3 次。⑤ 結(jié)果判定:所有柜內(nèi)實(shí)驗(yàn)組采樣平板上的枯 草桿菌黑色變種芽孢菌數(shù)之和應(yīng)≤5 cfu，陽性對照 采樣平板上菌數(shù)應(yīng) > 300 cfu，即可判定為合格。試 驗(yàn)重復(fù)3 次，均符合要求。
1. 2. 5 交叉污染保護(hù)測試 ① 調(diào)整好安全柜內(nèi)氣 流:將安全柜內(nèi)氣流速度設(shè)置為規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)值，讓安 全柜處于工作狀態(tài)。② 氣溶膠染菌準(zhǔn)備: 在 TK -2 氣溶膠發(fā)生器裝入含菌量為6. 5 ×104 /ml 的芽孢懸 液20 ml，置于安全柜內(nèi)，緊靠左側(cè)內(nèi)壁的中心，噴 射軸線在工作臺面上 12 cm 處，噴射方向平行于工 作臺面正對面的側(cè)壁。③ 布放采樣平板: 將敞開的 瓊脂培養(yǎng)皿從前至后排列在工作臺面上:2 排對照 培養(yǎng)皿位于 TK -2 氣溶膠發(fā)生器噴嘴下方;距噴霧 器所在側(cè)壁 36 cm 處放 1 排培養(yǎng)皿; 距噴霧器所在 側(cè)壁36cm 外放2 排培養(yǎng)皿。④ 開啟TK -2 氣溶膠 發(fā)生器，以流量 7. 5 L/min，噴霧5 min 后關(guān)閉;自然 沉降20 min 采樣，蓋上平板蓋。將所有采樣平板置 于37℃培養(yǎng)24 ～28 h 觀察結(jié)果，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。⑤ 另一側(cè)重復(fù):將噴霧器放于靠右側(cè)內(nèi)壁中央執(zhí)行上 述步驟。⑥ 結(jié)果判定:距被檢測側(cè)壁 36 cm 外的采 樣平板上枯草桿菌黑色變種芽孢菌數(shù)之和應(yīng)≤2 cfu;距被檢測側(cè)壁36 cm 內(nèi)的采樣平板( 陽性對照) 的枯草桿菌黑色變種芽孢菌數(shù)之和 > 300 cfu，即可 判定合格。安全柜的左右側(cè)均各重復(fù)試驗(yàn)3 次，每 次試驗(yàn)結(jié)果均符合要求。
1. 2. 6 下降氣流流速測試 在工作區(qū)上方高于前 窗操作口上沿10 cm 的水平面上方呈等距離安排測量點(diǎn)，形成15cm ×15cm 的正方形柵格，測試點(diǎn)至少 應(yīng)有3 排，每排 7 個(gè)測量點(diǎn)。測試區(qū)域邊界與安全 柜的內(nèi)壁及前窗操作口的距離應(yīng)為15 cm。用風(fēng)速 計(jì)探針準(zhǔn)確定位在各測量點(diǎn)進(jìn)行測量，記錄各測量 值并計(jì)算平均值。結(jié)果判定:下降氣流流速在0. 25 ～0. 5 m/s 之間為合格。
1. 2. 7 流入氣流流速測試 用風(fēng)速計(jì)在前窗操作 口平面測量兩排各點(diǎn)的氣流流速，第一排在前窗操 作口上沿下1/4 開口高度位置;第二排在前窗操作 口上沿下約3/4 開口高度位置; 測量點(diǎn)間隔 10 cm， 距前窗操作口的側(cè)邊不少于10 cm，計(jì)算各測量值 的平均值。結(jié)果判定: Ⅱ級 B1 型安全柜流入氣流 平均流速應(yīng)≥0. 5 m/s。
1. 2. 8 氣流煙霧模式測試 ①下降氣流測試: 煙 霧沿著工作表面的中心線，在前窗操作口頂端以上 10 cm 的高度，從安全柜的一端到另一端。②觀察 窗氣流測試: 煙在觀察屏后 2. 5 cm、前窗操作口頂 端以上15 cm 高度從安全柜的一端到另一端; ③前 窗操作口邊緣氣流測試:煙在安全柜外大約3. 8 cm 處沿著整個(gè)前窗操作口的周界經(jīng)過，特別應(yīng)注意角 落和垂直邊緣。④滑動窗密閉性測試:煙在滑動窗 內(nèi)從距安全柜側(cè)壁 5 cm 處沿工作區(qū)上沿經(jīng)過。⑤ 結(jié)果判定: A. 下降氣流和觀察窗氣流:工作區(qū)內(nèi)的 氣流應(yīng)向下，不產(chǎn)生旋渦和向上氣流且無死點(diǎn)，氣流 不從安全柜中逸出。B. 前窗操作口邊緣氣流氣流: 應(yīng)不從安全柜中溢出。C. 滑動窗密閉性: 前窗操作 口整個(gè)周邊氣流應(yīng)向內(nèi)，無向外逸出的氣流。前窗 操作口流入氣流應(yīng)不進(jìn)入工作區(qū)。
1. 2. 9 噪聲測試 ①打開安全柜的風(fēng)機(jī)和照明燈， 在安全柜前壁中心水平向外30 cm、工作臺面上方 38 cm 處測量噪聲。②關(guān)閉安全柜的風(fēng)機(jī)和照明 燈，在相同位置測量背景噪聲; ③當(dāng)背景噪聲大于 57 dB( A) 時(shí)，實(shí)測值按規(guī)定進(jìn)行修正。④結(jié)果判 定: ≤67 dB( A) 。 1. 2. 10 照度測試 在工作臺面上，沿工作臺面兩 內(nèi)側(cè)壁中心連線布點(diǎn)，測量點(diǎn)之間距離不超過 30 cm，與側(cè)壁較小距離為 15 cm;關(guān)掉安全柜的燈，從 一側(cè)起依次在測量點(diǎn)進(jìn)行背景照度測量。打開燈、 啟動風(fēng)機(jī)，從一側(cè)起依次測量臺面照度。結(jié)果判定: 平均照度≥650 lx，較低照度≥430 lx。
2 結(jié)果
2. 1 環(huán)境本底采樣測試結(jié)果 經(jīng)安德森二級采樣器對安全柜所在環(huán)境進(jìn)行的 采樣，所有平板上沒有枯草桿菌黑色變種芽孢生長。
2. 2 人員保護(hù)測試結(jié)果
3 次試驗(yàn)結(jié)果表明，所有 AGI 液體撞擊采樣器 采樣液接種的平板上生長的枯草桿菌黑色變種芽孢 菌數(shù)均符合≤10 cfu/皿，安德森采樣器采樣平板上 生長的枯草桿菌黑色變種芽孢菌數(shù)均≤5 cfu/皿，陽 性對照平板上枯草桿菌黑色變種芽孢菌數(shù) > 300 cfu/皿的標(biāo)準(zhǔn)要求( 表 1) 。
2. 3 產(chǎn)品保護(hù)測試結(jié)果 連續(xù) 3 次試驗(yàn)，在生物安全柜外人工發(fā)生氣溶 膠，布放在安全柜內(nèi)工作臺面上的共50 個(gè)采樣平板 上采集到的枯草桿菌黑色變種芽孢菌數(shù)之和分別為 3、 1、 2 cfu，均符合≤5 cfu 的標(biāo)準(zhǔn)要求; 陽性對照平 板上生長的枯草桿菌黑色變種芽孢菌數(shù)分別為 315、 335、 360 cfu/皿，均符合 > 300 cfu/皿的標(biāo)準(zhǔn)要 求( 表2) 。
2. 4 交叉污染保護(hù)測試結(jié)果 3 次測試結(jié)果表明，經(jīng)左右兩側(cè)向?qū)γ婀舴?向噴霧細(xì)菌氣溶膠，在距被檢測側(cè)壁 36 cm 外的10 個(gè)采樣平板上采集到的枯草桿菌黑色變種芽孢菌數(shù) 之和均≤2 cfu/皿;從試驗(yàn)側(cè)壁到距此側(cè)壁36 cm 范 圍內(nèi)的3 排15 個(gè)陽性對照采樣平板上采集到的枯 草桿菌黑色變種芽孢菌數(shù)之和均 >300 cfu/皿，結(jié)果 符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求( 表3) 。
2. 5 物理防護(hù)性能檢測結(jié)果
經(jīng)用不同儀器監(jiān)測結(jié)果證明，該生物安全柜啟 動運(yùn)行條件下，流入氣流流速、下降氣流流速、氣流 煙霧模式、噪聲和照度等物理防護(hù)性能指標(biāo)符合相 關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定( 表4) 。
3 討論 目前，國內(nèi)尚未出臺生物安全柜的國家標(biāo)準(zhǔn)，國 內(nèi)大多數(shù)生物安全柜都未能進(jìn)行防護(hù)性能檢測。 2006 年頒布實(shí)施的中國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) YY0569 - 2005《生物安全柜》 〔1〕，是在參考美國標(biāo)準(zhǔn) NSF49 - 2002〔2〕和歐洲標(biāo)準(zhǔn) EN12469 - 2000〔3〕基礎(chǔ)上制定， 其適用性有待大量檢測與科學(xué)驗(yàn)證，以便更適合本 國國情。本次依照現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)，對本中心已經(jīng)使用 3 年時(shí)間的美國進(jìn)口 LABCONCOⅡ級 B1 型生物安全 柜進(jìn)行了人員保護(hù)、產(chǎn)品保護(hù)、交叉污染保護(hù)等生物 防護(hù)性能和氣流煙霧模式、下降氣流流速、流入氣流 流速、噪聲、照度等物理防護(hù)性能指標(biāo)進(jìn)行了檢測。 檢測結(jié)果證明，該生物安全柜生物和物理防護(hù)性能 都符合標(biāo)準(zhǔn)要求，與出廠時(shí)檢測的結(jié)果一致，說明我 國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) YY0569 -2005 檢測方法具有較好的靈 敏性、可重復(fù)性和適用性。 人員保護(hù)測試布點(diǎn)都是設(shè)在安全柜氣流屏障薄弱的位置，檢測結(jié)果具有較好的代表性。由于在 安全柜內(nèi)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，手臂能干擾氣流，因此，四個(gè) AGI 液體采樣器采樣點(diǎn)設(shè)在模擬手臂擺放的位置;上方的兩個(gè) AGI 液體采樣器設(shè)在模擬人員操作時(shí) 口鼻所處位置，而 A GI 采樣器結(jié)構(gòu)亦設(shè)在模擬人員 呼吸的自然通氣量和呼吸道生理曲度。Ⅱ級生物安 全柜的兩側(cè)前窗滑軌處容易引起氣流紊亂，是氣幕 屏障的另一個(gè)薄弱環(huán)節(jié)，因此在此處選用的兩個(gè)安 德森采樣器進(jìn)行30 min 空氣微生物采樣，能靈敏地 監(jiān)測外逸的氣溶膠細(xì)菌含量。 因枯草桿菌黑色變種芽孢抗力強(qiáng)，國外 NSF49 -2002 和 EN12469 - 2000 兩大生物安全柜標(biāo)準(zhǔn)都 將其作為生物安全柜生物防護(hù)性能檢測的指示菌 株，但其制備較費(fèi)時(shí)，且難以消毒，不利于儀器設(shè)備 的周轉(zhuǎn)，不適宜現(xiàn)場連續(xù)檢測工作;若環(huán)境中殘留的 細(xì)菌芽孢消毒不徹底，容易造成后續(xù)檢測的假陽性。 因此，選擇易消毒、自然空氣中的非優(yōu)勢菌株來代替 枯草桿菌黑色變種芽孢作為指示菌株，有待進(jìn)一步 研究〔4〕。 另外，該行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中尚缺生物安全柜高效排風(fēng) 過濾器生物氣溶膠泄露的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法;而用風(fēng)速 儀法測流入氣流流速時(shí)，其采樣方法需依據(jù)安全柜 分型不同而異，如 B2 型因排風(fēng)管密閉根本無法測 量，因此，我國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) YY0569 -2005 在一些 項(xiàng)目的檢測方法上有待進(jìn)一步完善。
